信号通路免疫荧光显微镜解析

发布时间:2026-07-15 10:43:20

检测项目

MAPK/ERK通路磷酸化蛋白:检测ERK1/2、p38、JNK等关键激酶的磷酸化水平,反映通路激活状态。

PI3K/AKT通路关键节点:可视化磷酸化AKT(Ser473/Thr308)及下游分子,评估细胞存活与代谢信号。

Wnt/β-catenin通路核转位:通过β-catenin在细胞核内的聚集情况,判断经典Wnt信号通路的活性。

NF-κB通路核转位:观察p65等亚基从胞质向胞核的转移,指示炎症或应激信号的激活。

JAK-STAT通路磷酸化STAT:检测STAT家族蛋白(如STAT3)的酪氨酸磷酸化及核定位。

TGF-β/Smad通路Smad复合物:可视化磷酸化Smad2/3的核内积聚,反映TGF-β超家族信号强度。

细胞凋亡相关蛋白:检测Cleaved Caspase-3、PARP等剪切形式,定位发生凋亡的单个细胞。

自噬标志物LC3点状聚集:通过LC3-II在自噬体膜上的点状分布,定量分析自噬流水平。

细胞周期蛋白表达与定位:观察Cyclin B1、p21等蛋白的亚细胞分布变化,关联细胞周期进程。

受体酪氨酸激酶激活与内吞:追踪EGFR、FGFR等受体在配体刺激后的磷酸化及膜内吞过程。

检测范围

贴壁细胞系:适用于HEK293、HeLa、MCF-7等多种培养于玻底皿或盖玻片上的细胞。

原代培养细胞:可用于神经元、肝细胞、免疫细胞等难转染原代细胞的信号通路研究。

组织切片:对石蜡包埋或冰冻组织切片进行信号蛋白定位,分析病理生理状态下的通路变化。

三维细胞球体:通过共聚焦显微镜Z轴扫描,解析球体内部不同区域细胞的信号异质性。

细胞骨架共定位:与Phalloidin(F-actin)或微管蛋白共染,研究信号通路与细胞形态的关联。

细胞器共定位:与线粒体、内质网、高尔基体等标记物共染,确定信号蛋白的精确亚细胞定位。

蛋白质相互作用邻近检测:结合PLA(邻位连接技术)或FRET,在显微镜下验证信号通路中蛋白的直接互作。

活细胞动态成像:使用表达荧光融合蛋白的细胞系,实时观测信号传导事件的时空动态。

药物或基因扰动效应:评估小分子抑制剂、siRNA或CRISPR敲除后特定信号节点的变化。

发育与分化过程:追踪胚胎干细胞或组织发育过程中关键信号通路的时空调控模式。

检测方法

细胞固定与通透:使用4%多聚甲醛或冷甲醇固定细胞,Triton X-100或皂苷进行膜通透处理。

抗原修复:对组织切片或某些抗原,采用热诱导表位修复法以恢复被遮蔽的抗原位点。

封闭与非特异性结合抑制:用BSA、血清或脱脂奶粉封闭,减少抗体非特异性吸附。

一抗孵育:使用针对目标磷酸化位点或总蛋白的特异性一抗,在湿盒中4℃过夜孵育。

二抗孵育:选用与一抗种属匹配、偶联有荧光染料(如Alexa Fluor系列)的二抗进行标记。

细胞核复染:使用DAPI、Hoechst等染料对细胞核进行染色,用于定位和细胞计数。

封片与抗淬灭:使用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片,以延长样本保存时间并增强信号稳定性。

多色荧光标记策略:设计不同物种来源的一抗组合及光谱不重叠的二抗,实现多重信号同时检测。

图像采集与Z轴层扫: 设置合适的曝光时间、分辨率和Z轴步进,获取多通道三维图像数据。

>图像定量分析>: 利用ImageJ、Imaris等软件对荧光强度、共定位系数(Pearson‘s coefficient)、核质比等进行定量统计。

检测仪器设备

>宽场荧光显微镜>: 配备汞灯或LED光源及特定滤光片组,用于快速筛查和低倍率成像。

>激光扫描共聚焦显微镜>: 核心设备,利用针孔消除离焦光,获得高分辨率、高对比度的光学切片图像。

>转盘式共聚焦显微镜>: 通过高速旋转的尼普科夫盘实现快速共聚焦成像,更适合活细胞动态观察。

>超高分辨率显微镜>: 如STORM/PALM或STED,突破光学衍射极限,用于纳米尺度下的信号蛋白簇研究。

>全内反射荧光显微镜>: 仅激发样本表面约100nm薄层,特别适用于研究质膜附近的信号事件。

>活细胞培养系统>: 集成于显微镜的温控、CO2及湿度控制装置,确保长时间活细胞成像的生理环境稳定。

>高灵敏度相机>: sCMOS或EMCCD相机,具有高量子效率和低读出噪声,用于检测微弱荧光信号。

>激光器与滤光片组>: 提供405nm、488nm、561nm、640nm等多波长激光及相应的发射滤光片,满足多色成像需求。

>图像工作站与分析软件>: 高性能计算机配备专业图像采集与分析软件(如Zen, NIS-Elements, MetaMorph)。

>自动玻片扫描仪>: 高通量自动对焦并扫描整张组织切片玻片,适用于大样本量的病理学信号通路分析。

检测服务流程

沟通检测需求:为精准把握客户需求,我们会仔细审核申请内容,与客户深入交流,精准识别样品类型、明确测试要求,全面收集相关信息,确保无遗漏。

签订协议:根据沟通确定的检测需求及商定的服务细节,为客户定制包含委托书及保密协议的个性化协议。后续检测严格依协议执行。

样品前处理:收到样品后,开展样品预处理、制样及标准溶液制备等前处理工作。凭借先进仪器设备和专业技术人员,科学严谨对待每个细节,保证前处理规范准确。

试验测试:此为检测核心环节。运用规范实验测试方法精确检测每个样品,实验设计与操作均遵循科学标准,保障测试结果准确且可重复。

出具报告:测试结束立即生成详尽检测报告,经严格审核确保结果可靠准确,审核通过后交付客户。

我们秉持严谨踏实的态度,提供高品质、专业化检测服务。服务全程可追溯,严格遵守保密协议,保障客户满意度与信任度。

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