
MAPK/ERK通路磷酸化蛋白:检测ERK1/2、p38、JNK等关键激酶的磷酸化水平,反映通路激活状态。
PI3K/AKT通路关键节点:可视化磷酸化AKT(Ser473/Thr308)及下游分子,评估细胞存活与代谢信号。
Wnt/β-catenin通路核转位:通过β-catenin在细胞核内的聚集情况,判断经典Wnt信号通路的活性。
NF-κB通路核转位:观察p65等亚基从胞质向胞核的转移,指示炎症或应激信号的激活。
JAK-STAT通路磷酸化STAT:检测STAT家族蛋白(如STAT3)的酪氨酸磷酸化及核定位。
TGF-β/Smad通路Smad复合物:可视化磷酸化Smad2/3的核内积聚,反映TGF-β超家族信号强度。
细胞凋亡相关蛋白:检测Cleaved Caspase-3、PARP等剪切形式,定位发生凋亡的单个细胞。
自噬标志物LC3点状聚集:通过LC3-II在自噬体膜上的点状分布,定量分析自噬流水平。
细胞周期蛋白表达与定位:观察Cyclin B1、p21等蛋白的亚细胞分布变化,关联细胞周期进程。
受体酪氨酸激酶激活与内吞:追踪EGFR、FGFR等受体在配体刺激后的磷酸化及膜内吞过程。
贴壁细胞系:适用于HEK293、HeLa、MCF-7等多种培养于玻底皿或盖玻片上的细胞。
原代培养细胞:可用于神经元、肝细胞、免疫细胞等难转染原代细胞的信号通路研究。
组织切片:对石蜡包埋或冰冻组织切片进行信号蛋白定位,分析病理生理状态下的通路变化。
三维细胞球体:通过共聚焦显微镜Z轴扫描,解析球体内部不同区域细胞的信号异质性。
细胞骨架共定位:与Phalloidin(F-actin)或微管蛋白共染,研究信号通路与细胞形态的关联。
细胞器共定位:与线粒体、内质网、高尔基体等标记物共染,确定信号蛋白的精确亚细胞定位。
蛋白质相互作用邻近检测:结合PLA(邻位连接技术)或FRET,在显微镜下验证信号通路中蛋白的直接互作。
活细胞动态成像:使用表达荧光融合蛋白的细胞系,实时观测信号传导事件的时空动态。
药物或基因扰动效应:评估小分子抑制剂、siRNA或CRISPR敲除后特定信号节点的变化。
发育与分化过程:追踪胚胎干细胞或组织发育过程中关键信号通路的时空调控模式。
细胞固定与通透:使用4%多聚甲醛或冷甲醇固定细胞,Triton X-100或皂苷进行膜通透处理。
抗原修复:对组织切片或某些抗原,采用热诱导表位修复法以恢复被遮蔽的抗原位点。
封闭与非特异性结合抑制:用BSA、血清或脱脂奶粉封闭,减少抗体非特异性吸附。
一抗孵育:使用针对目标磷酸化位点或总蛋白的特异性一抗,在湿盒中4℃过夜孵育。
二抗孵育:选用与一抗种属匹配、偶联有荧光染料(如Alexa Fluor系列)的二抗进行标记。
细胞核复染:使用DAPI、Hoechst等染料对细胞核进行染色,用于定位和细胞计数。
封片与抗淬灭:使用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片,以延长样本保存时间并增强信号稳定性。
多色荧光标记策略:设计不同物种来源的一抗组合及光谱不重叠的二抗,实现多重信号同时检测。
图像采集与Z轴层扫强>: 设置合适的曝光时间、分辨率和Z轴步进,获取多通道三维图像数据。
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