流式细胞仪蛋白磷酸化测定

发布时间:2026-05-30 10:28:43

检测项目

p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204):检测细胞外信号调节激酶的活化状态,反映生长因子受体和MAPK通路活性。

p-AKT (Ser473):评估PI3K/AKT/mTOR信号通路的核心节点,与细胞存活、增殖和代谢密切相关。

p-STAT3 (Tyr705):分析JAK/STAT信号通路的激活,常用于研究炎症、免疫反应和肿瘤发生。

p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182):监测p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化,参与应激反应和细胞凋亡。

p-NF-κB p65 (Ser536):衡量经典NF-κB通路的激活水平,是炎症和免疫应答的关键转录因子。

p-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236):作为mTORC1通路下游的直接效应物,指示蛋白质合成速率。

p-Histone H3 (Ser10):评估有丝分裂的进程,其磷酸化水平在染色体凝集时显著升高。

p-CREB (Ser133):检测cAMP反应元件结合蛋白的活化,涉及神经元可塑性、记忆形成等过程。

p-FAK (Tyr397):分析黏着斑激酶的自身磷酸化,反映细胞粘附、迁移和整合素信号。

p-p53 (Ser15):监测肿瘤抑制蛋白p53在DNA损伤应激下的稳定与活化。

检测范围

外周血单个核细胞:包括T细胞、B细胞、NK细胞等,用于评估免疫细胞在疾病或药物处理下的信号状态。

培养的肿瘤细胞系:广泛应用于癌症研究,用于筛选靶向药物及研究耐药机制。

原代干细胞及祖细胞:研究发育、分化过程中的关键信号事件。

血小板:分析凝血激活、血小板聚集相关的信号通路变化。

白血病患者骨髓样本:直接对病理细胞进行功能性信号分析,辅助分型和预后判断。

实体瘤组织消化后的单细胞悬液:从复杂组织中解析异质性细胞的磷酸化特征。

小鼠脾脏、淋巴结等免疫器官细胞:在动物模型中系统性研究免疫信号网络。

细胞内病原体感染的宿主细胞:探究病原体感染如何劫持或改变宿主细胞的信号传导。

药物处理后的动态时间点样本:追踪信号分子从秒到小时的快速磷酸化动力学。

不同细胞周期阶段的细胞群:通过DNA染料共染色,关联特定磷酸化事件与细胞周期进程。

检测方法

细胞固定:使用多聚甲醛等交联剂快速固定细胞,终止信号反应并保持磷酸化状态。

透膜处理:使用甲醇或非离子型去垢剂破坏细胞膜,使抗体能够进入胞内结合靶标。

磷酸化特异性抗体标记:使用与荧光染料偶联的、针对特定磷酸化位点的单克隆抗体进行孵育染色。

表面标志物共染色:在固定透膜前或后,使用不同荧光素的抗体标记细胞表面抗原,用于细胞分群。

刺激与抑制实验:在测定前用生长因子、细胞因子、药物或通路抑制剂处理活细胞,以观察信号变化。

细胞内荧光强度定量:通过流式细胞仪检测每个细胞的荧光强度,其均值或中位值代表磷酸化水平。

<强健的多色面板设计: 精心选择荧光染料组合,同时检测多个磷酸化蛋白及表型标志物。

<强健的未刺激/同型对照设置: 必须设置未经刺激的阴性对照和同型抗体对照,以确定背景和非特异性结合水平。

<强健的数据标准化: 常采用MFI(平均荧光强度)比值(刺激组/未刺激组)或Z因子来量化磷酸化变化倍数。

<强健的统计分析: 应用流式数据分析软件进行门控、统计比较(如t检验、ANOVA)和图形可视化(直方图、散点图)。

检测仪器设备

<强健的流式细胞仪主机: 核心设备,负责产生液流、激发荧光并收集光信号,如BD FACSCanto, Beckman Coulter CytoFLEX等。

<强健的激光器: 提供特定波长的激发光,常见有488nm蓝激光、640nm红激光、405nm紫激光等,用于激发不同荧光染料。

<强健的光学滤片系统: 包括带通、长通和短通滤片,用于分离和收集特定波段的发射荧光。

<强健的荧光检测器(PMT): 光电倍增管将微弱的光信号放大并转换为电信号,其电压设置直接影响检测灵敏度。

<强健的液流系统与鞘液: 产生稳定的层流,使单细胞依次通过激光检测区;鞘液通常为无菌PBS或专用缓冲液。

<强健的上样系统: 包括试管架或孔板进样器,实现单个或多个样本的自动连续检测。

<强健的控制与分析软件: 仪器操作软件(如BD FACSDiva)控制参数设置和数据采集;分析软件(如FlowJo, FCS Express)用于数据处理。

<强健的涡旋振荡器: 用于充分混匀细胞悬液和抗体,确保染色均匀一致。

<强健的高速低温离心机: 用于细胞的洗涤、沉淀等步骤,低温环境有助于维持样本稳定性。

<强健的生物安全柜或超净工作台: 为处理原代样本或无菌操作提供洁净环境,防止污染并保障操作者安全。

检测服务流程

沟通检测需求:为精准把握客户需求,我们会仔细审核申请内容,与客户深入交流,精准识别样品类型、明确测试要求,全面收集相关信息,确保无遗漏。

签订协议:根据沟通确定的检测需求及商定的服务细节,为客户定制包含委托书及保密协议的个性化协议。后续检测严格依协议执行。

样品前处理:收到样品后,开展样品预处理、制样及标准溶液制备等前处理工作。凭借先进仪器设备和专业技术人员,科学严谨对待每个细节,保证前处理规范准确。

试验测试:此为检测核心环节。运用规范实验测试方法精确检测每个样品,实验设计与操作均遵循科学标准,保障测试结果准确且可重复。

出具报告:测试结束立即生成详尽检测报告,经严格审核确保结果可靠准确,审核通过后交付客户。

我们秉持严谨踏实的态度,提供高品质、专业化检测服务。服务全程可追溯,严格遵守保密协议,保障客户满意度与信任度。

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